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PCR实验室污染与防控

    在众多的生物实验室中,分子生物学检测方法如PCR因其检测灵敏度高、准确度好、操作方便、快速等优势已经被广泛应用。不过正是由于它的高灵敏性,实验室中极微量的污染源都有可能导致检测结果的假阳性,所以对环境中污染源的防控也极为重要。一旦出现实验室环境污染,比如样本之间交叉污染、试剂污染、仪器污染、阳性对照污染、PCR扩增产物污染、气溶胶污染等,其中气溶胶污染是一个非常重要而被忽视的污染源。实验室出现气溶胶污染,需要较长的时间进行根除。

一、污染原因

    1、样本之间交叉污染。

    标本污染主要有收集标本的容器被污染;标本存放运输时,由于密封不严或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;核酸模板在提取过程中,由于加样枪污染导致标本间污染;手动提取核酸样本时,污染的手套触摸离心管内盖导致的污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染。

    2、PCR试剂污染

    PCR试剂在配制过程中,移液枪、枪头、离心管等原因造成试剂被PCR核酸模板污染。

    3、不同工作区域移液枪等耗材交叉使用。

    将易污染区域的移液枪、枪头、离心管等耗材拿到洁净区使用引起的污染;

    4、离心机转子未定期擦拭。

    离心机通常进行各种试剂组分、不同盲样的离心,如果离心管外部沾染病毒、阳性核酸或阳性质粒,容易造成污染。

    5阳性对照造成的污染。

    开盖时间过长高浓度质粒挥发到室内,阳性对照组分未使用完任意丢弃,加完阳性对照的枪头未放入消毒液中。

    6扩增产物开盖造成的污染。

    这是PCR试验中最主要、最常见的污染原因。因为PCR产物拷贝量大,远远高于PCR检测拷贝的极限,PCR产物开盖后,极易迅速造成扩散,极微量的PCR产物污染,就可形成假阳性。

    7各个实验室擦桌布、扫把,簸箕,工作服交叉使用。

二、PCR污染的监测

    一个正规的实验室,要时刻注意监测实验室的污染情况。了解实验室有无污染,污染原因,污染程度,以便采取有效措施,防止和消除污染。一般通过阴阳性对照检测污染情况。

    1、阴性对照:

    不将模板DNA或RNA加入到PCR试剂中,进行PCR扩增,对试剂是否污染进行监测。阴性水样参与核酸提取和扩增监测整个试验流程是否正规。

    2、阳性对照:

    PCR阳性对照对于被建立PCR反应实验室及一般的检验单位都是必需设有的, PCR反应是否成功,PCR阳性对照是一个重要的参考标志。

    如果阴性对照和阳性对照均成立,说明质量控制成立,实验室未被污染,样本检测结果才有效。

    如果阴性对照不成立,出现扩增曲线,说明阴性对照被核酸污染,需要追溯污染源。

试剂污染

重新更换新拆封的合格试剂检测,

如果阴性对照仍然有扩增曲线,初步判定为实验室污染。

    实验室污染

监控对象:实验室内的仪器设备、空气、物体表面

监测方法:1.1水样验证:每个实验区放置10ml单蒸水水(敞口),1个小时后,取样200ul。

1.2物体表面擦拭取样:用棉拭子蘸取生理盐水,在实验室台面(尤其是四周死角)、仪器表面和内孔涂抹取样后放入约0.5mL生理盐水中取样。


三、解决PCR实验室污染的方法


    (1)开窗通风:如在短时间内要消除实验室污染,开窗通风促进实验室内空气流通,使停留在室内的核酸排放到室外。

    (2)紫外灯照射:将实验室内生物安全柜内物品平铺,打开离心机内盖,然后将紫外等打开照射12-24小时,通风12小时以上

    (3)消毒液降解核酸:及时用1%-2%的次氯酸钠擦拭操作台面和仪器,用10%次氯酸钠浸泡试验器具,同时用10%次氯酸钠洗拖布擦拭地面。

    (4)高压:试验耗材、工作衣进行121℃30分钟高压

    (5)使用商品化核酸去除剂喷洒室内降解核酸。

    (6)阳性污染特别严重,可以采取高锰酸钾甲醛(2:1)过夜熏蒸实验室。

四、PCR实验室如何预防污染

    1、合理的实验室分区


    2、实验操作流程:

    (1)样品制备区进行样品处理,核酸提取;

    (2)配液区配置反应体系:酶混合液和PCR反应液混合,分装至PCR反应管

    (3)样品制备区加样:样核酸和阴阳性对照加至反应液中;

    (4)PCR扩增区上机扩增检测。务必保持单向操作流程,避免各区实验室污染

    3、各个实验区内试验用品专区专用

    配液区是最洁净的试验区域样品制备区的洁净度稍差, PCR扩增区是最易被污染的区域,各区之间试验物品专区专用,避免因交叉使用造成实验室污染。

             4、试验操作要规范

    (1)正确使用移液枪,保证试剂配比计量正确,同时避免液体吸入移液枪口造成污染

    (2)实验的过程中应勤换手套,在进出不同区域或进行模板操作后,都应及时更换手套。

    (3)试剂盒各组分在打开之前应先做瞬时离心(约10s),将管壁及管盖上的液体甩至管底部,从而减少污染手套或加样器的机会。开管动作要轻,以防管内液体溅出或形成气溶胶,造成污染。

    (4)样本量较多时,应将反应液预混,再分装至PCR反应管,最后添加核酸模板,以减少单个添加操作繁琐造成的污染。

    (5)每次试验必须设定阴性对照和阳性对照,读取结果时,在保证阴阳性对照均成立的情况下,判读样本结果才有效。

    (6)实验结束后PCR反应管严禁打开,及时放置次氯酸钠消毒液中浸泡。

    5、做好日常消毒工作

    每日工作完成后,及时处理实验室内废弃物,消毒液擦拭操作台面和仪器,拖布蘸取消毒液擦拭地面,开窗同风10分钟以上。

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